Sekuensing DNA

Sequencing DNA

Sekuensing DNA

Pangèrtosan DNA Séquencing

Secara molékulèr, pangèrtosan saking molékul DNA asalipun saking penentuan sèkuèn nukèotida. Mupangatipun saking gèn asring saged dipuntemtuaken adédasar sekuen nukeotida, tuladhanipun ginaakén cara bandingakén sékuens nukeotida kaliyan gèn ingkang sampun dipunmangèrtosi mupangatipun. sekuen nukleotoda DNA saged dipuntemtuaken adédasar mètode saking Alan Maxam saha Walter Gilbert utawi dipunsébat ugi sekuens ingkang adédasar prosedur kimia. Mètodé punika bétahakén labèl radioaktif ing satunggal ujung saha pemurnian fragmèn DNA ingkang badhé dipunsekuens. Perlakuan kimia ngasilaken kaputusan ing proporsi alit sétunggal utawi kalih saking sékawan basa nukleotida ing sabén-sabén rèaksi G, A+G,C,C+T. Saéngga sèri saking fragmèn dipunhasilakén saking ujung ing radiolabèl. Fragmèn kaping sékawan rèaksi dipunatur ing sisih gel Èlèktroforèsis kanggé misahaken adédasar ukuran.(dipununduh Tanggal 13 Oktober 2012) Teknik sekuensing DNA dipunrembaaken ing taun 1970an saha sampun dados hal rutin ing panalitèn biologi molekular ing dekade salajengipun kalih metode ingkang dipunrembaaken kanti cara independen nanging miturut Walter Gilbert ing Amérikah Sarékat saha tim Frederick Sanger ing Inggris saéngga sadaya ilmuan kemau ngasilaken Penghargaan Nobel Kimia ing taun 1980.(dipununduh Tanggal 14 Oktober 2012)

Cycle Sequencing inggih punika mètodé ingkang prasaja ing pundi pengulangan denaturasi, annealing saha ekstensi kanthi runtut ing salébéting Thermal cycler ngasilaken amplifikasi linear produk-produk Èkstènsi. Produk punika dipunload ing gel utawi dipuninjeksiaken ing salébéting kapiler. Applied Biosystems ngginakaken protokol cycle sequencing ing kit DNA sequencing.(dipununduh Tanggal 13 Oktober 2012)

Kagunaan Cycle Sequencing

1. Protokolipun saé lan gampil kanggé ngélampahi 2. Cycle Sequencing bétahakén DNA tèmplatè ingkang langkung kédik dipunbandingaken mètodé ekstensi temperatur tunggal. 3. Cycle Sequencing langkung jumbuh dipunbandingaken metode pelabelan temperatur tunggal tradhisional ingkang butuhaken langkah denaturasi kimiawi kanggé template utus ganda. 4. Temperatur inggil ngurangi annealing sekunder promer ing template. 5. Protokol ingkang samidipunginaaken kanggé DNA utus ganda utawi utus tunggal. 6. Protokol punika merdamel kanti saé kanggé sequencing PCR produk. 7. Temlate-template ingkang boten gampil, kados ta bacterial artificial chromosomes BACs saged dipunsekuen.(dipununduh Tanggal 13 Oktober 2012)

Prinsip Dasar DNA Sequencing

DNA Sequencing ngginakaken metode PCR Polymerase Chain Reaction dados pijakan. DNA ingkang badhé dipuntemtuaken urutab basa ACGTipun dipundadosaken cinetak Template salajengipun dipunamplifikasiaken ngginakaken enzim lan woh-wohan ingkang sami kaliyan reaksi PCR, nanging wonten penambahanipun pinten-pinten reaksi katamtu. Prosès punika dipunsebat cycle sequencing. Ing prosès ekstensi. Prosès ekstensi, enzim polimerase badhé damel urutan rantai énggal DNA salinan sakig template kaliyan nambahaken dNTP dNTP jumbuh kaliyan urutan ing DNA cinetakipun. Manawi ingkang nempel inggih punika ddNTP, mila prosès polimerisasi badhé mendhek amergi ddNTP boten gadhah 3-OH ingkang kedahipun ngereaksi kaliyan gugus 5-fosfat ing dNTP salajengipun wujud ikatan posfodiester. Ing pungkasan cycle sequencing ingkang dipunhasilaken inggih punika fragmen-fragmen DNA ingkang dawa. Manawi fragmen-fragmen mau dipunpisahaken kaliyan elektroforesis, mila badhé kapisah-pisah kaliyan jarak antawis fragmanipun satunggal basa.(dipununduh Tanggal 13 Oktober 2012)

Sekuensing DNA

Sedaya usaha sekuensing DNA dipunlampahi kaliyan ngginakaken metode terminasi rantai ingkang dipunrembag déning Frederick Sanger saha kanca-kanca. Teknik mau ngelibataken terminasi utawi dipunhentiaken reaksi sintesis DNA in vitro ingkang spesifik kanggé sekuens katamtu ngginakaken substrat nukleotida ingkang sampun dipunmodifikasiaken. Metode sanger gel sekuensing metode sanger ingkang sampun dipunlabel radio aktif. Ing metode terminasi rantai metode sanger, ekstensi rantai DNA dipunwiwiti ing situs spesifik DNA cinetak kaliyan ngginakaken oligonukleotida alit ingkang dipunsebat primer ingkang komplementer kaliyan DNA ing daerah situs mau. Primer mau dipundawaaken ngginakaken DNA polimerase, enzim dipundereaken sekawan jinis basa deoksinukleotida, ugi nukleotida dipunhentiaken terminor rantai ing konsèntrasi cendhèk. Gabungan nukleotida mau, kanthi kabates ing rantai DNA déning polimerase DNA ngasilaken fragmen-fragmen DNA mau, lajeng dipunpisahaken miturut ukuranipun kaliyan elektroforesis gel poliakrilamida utawi ing jaman saiki elektroforesis ngginakaken tabung gelas jari-jari alit.lajenh dipunparingi isi kaliyan polimer kentel.(dipununduh Tanggal 13 Oktober 2012)